T E L O M E R O S

Profesor: Dr. Egon R. Casanova M.D. (*)

Summary: A review of what the telomeres are and their potential usefulness in clinical practice is made. Telomeres mark the end region of each chromosome, signaling the point at which the DNA strands start of ending. Physiologically telomeres are important in aging and pathophysiologically in the maintenance of malignant process. Telomeres do not codify molecules and are not repaired when damaged; being dispensable, so they represent a molecular clock that controls the life span of every dividing cells of the body. With each cell division telomeres shorten until a critical length where apoptosis is induced. Immortal abnormal cell populations overcome telomere shortening by activating the enzyme telomerase, which catalyzes the synthesis of the TTAGGG sequences that compose mammalian telomeres, maintaining their length constant. Only a few normal bunch of cells, totipotent stem cells of the bone marrow, germinal cells and embryonic cells, have telomerase activity.
Several cancers have been studied finding high levels of telomerase activity. Cancer of thyroid, prostate, colon and pancreas at initial stage show 90 – 95% of high levels of telomerase activity. In cervical uterine cancer 88% of patients have high levels of telomerase activity with 9% of false positive, as is in 90% of liver, lungs, breast and skin cancer and in between 70 – 100% of patients with leukemias and lymphomas. On the other side, 90% of patients with incipient vesical cancer detected in voided urine or bladder washings have high telomerase activity. In addition, this increased activity of telomerase is associated to a bad prognosis in meningioma, neuroblastoma, acute leukemia, breast and gastrointestinal cancer. All these facts open an important way of studying and developing new forms of cancer treatment. At present, investigation is actively carried out with inhibitors of telomerase in order to stop growth and induce the death of the malignant cells. On the other hand, the use of telomerase may be of value in tissue repair and in prolonging life.



(*) Profesor Asistente Hematología. Departamento de Fisiopatología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad de Concepción. Concepción – Chile. Médico Servicio de Medicina Interna y Jefe Banco de Sangre. Hospital Naval de Talcahuano – Chile.


El DNA se puede comparar con un cierre o corredera en el sentido que sus hebras se pueden abrir y cerrar. La separación de algunas secciones de las hebras permite transcribir al mRNA la información codificada que posee, o bien la apertura o separación total de ambas hebras permite la duplicación del DNA. Cada cromosoma consiste básicamente en una molécula de DNA, constituida por aproximadamente 150 millones de pares de desoxinucleótidos. En las células eucarióticas como por ejemplo células humanas el DNA es lineal a diferencia del DNA de las bacterias (procarióticas) que es circular.
Los telómeros corresponden a secuencias de nucleótidos ubicados al final de cada hebra de DNA (total 92 secuencias terminales: 46 cromosomas x 2 puntas), en contraposición con los centrómeros que se encuentran en el centro de los cromosomas. Los telómeros cumplen importantes funciones, protegen al DNA, facilitan la replicación de el y estabilizan sus secuencias terminales. Fisiológicamente, los telómeros controlan el envejecimiento y fisiopatológicamente juegan un rol fundamental en la mantención de diferentes procesos malignos. Los telómeros consisten en secuencias de nucleótidos o bases nitrogenadas repetidas aproximadamente 15.000 veces formados por (TTAGGG)n (1).

5´ - TTAGGGTTAGGGTTAGGG - 3´
3´ - AATCCCAATCCCAATCCC - 5´

Estas secuencias finales, son reconocidas como el término normal de la hebra de DNA por los mecanismos de control fisiológicos celulares, cualquier otra secuencia es interpretada como daño (ruptura) lo que activa los mecanismos reparadores del DNA (p53, pRb). Por otra parte, los telómeros no codifican moléculas y no son reparados si se dañan siendo por lo tanto prescindibles. Se ha podido establecer que en cada división celular siempre va quedando un segmento telomérico final que no es duplicado perdiéndose, lo cual lleva a un progresivo acortamiento en la longitud de los telómeros limitando el número de veces que la célula se divide y que llegado a un cierto número crítico de divisiones la célula muere, si esto se extrapola a la economía como un todo implica la muerte del individuo por envejecimiento (2). De este modo los telómeros cumplen perfectamente la función de conteo o de reloj molecular para envejecimiento y como señal indicadora que hasta ese punto se extiende la hebra de DNA (3).
Normalmente, la duplicación del DNA tanto en células procarióticas como eucarióticas requiere de un partidor (primer) que es RNA al cual se acopla la DNA polimerasa (pol III). Para tal objeto, durante la fase S del ciclo celular se activa en el núcleo una RNA polimerasa que cataliza la síntesis de 10 – 12 ribonucleótidos del partidor RNA complementarios al DNA molde que se ha abierto para duplicarse, este RNA primer o partidor proporciona el grupo hidroxilo OH presente en 3´ para agregar desoxinucleótidos mediante la DNA polimerasa (normalmente la síntesis del nuevo DNA se hace desde 3´ hacia 5´ tomando como referencia el molde de DNA) proceso que continúa hasta incorporar 100 – 150 desoxinucleótidos constituyendo estos los fragmentos de Okasaki.

Este proceso se lleva a cabo simultáneamente en diferentes sitios de la hebra, se estima en a lo menos 1000 sitios diferentes (1000 fragmentos de Okasaki), lo que permite duplicar el DNA en menor tiempo (4 – 8 horas) que si se produjera solamente desde un solo punto. Una vez duplicado el DNA, se elimina por hidrólisis enzimática el partidor RNA mediante una exonucleasa o ribonucleasa específica y se cierra el espacio con los desoxinucleótidos complementarios correspondientes por acción enzimática de la DNA polimerasa. Cuando se llega al espacio mínimo se cierra el extremo 3´ con el 5´ del DNA duplicado por medio de una DNA ligasa. Sin embargo, la duplicación fisiológica del DNA lineal característico de las células eucarióticas, presenta un problema importante que es la incapacidad de sintetizar totalmente el extremo 5´ de la hebra hija de DNA, es decir el final 5´ de cada hebra nueva sintetizada no puede ser completado. Al comienzo en el extremo 3´ del DNA molde, se posiciona el RNA primer que inicia la duplicación el cual presenta el grupo 3´ OH para que la DNA polimerasa incorpore los nucleótidos por su extremo 5´. Este RNA primer una vez cumplida su misión, es digerido por una exonucleasa quedando la secuencia de DNA molde sin posibilidad de duplicarse por no poder actuar la DNA polimerasa, lo que resulta en la eliminación por hidrólisis de la secuencia telomérica perdiéndose entre 25 – 200 nucleótidos teloméricos en el extremo 5´ de la nueva hebra de DNA sintetizada, de esta manera los telómeros se van reduciendo con cada división celular (4,5) (figura: 1).
Los telómeros serán mas cortos mientras mayor sea la edad y en cultivos de células normales in-vitro el acortamiento telomérico junto a la ausencia de factores estimulantes limita la sobrevida celular. De tal modo que la longitud de los telómeros determina el número de veces que se dividirá la célula y la muerte celular por envejecimiento.
La telomerasa es una polimerasa (complejo ribonucleoproteico) formada por las dos moléculas necesarias para la síntesis de DNA; por una parte el RNA denominado hTR (human Telomerase RNA) que constituye el partidor o primer expresado en todas las células de la economía, constituido por 10 – 12 ribonucleótidos complementarios al DNA telomérico y por otra parte, por la proteína catalítica que es la transcriptasa reversa de la telomerasa humana (human telomerase reverse transcriptase) denominada hTERT que es la DNA polimerasa encargada de sintetizar el DNA telomérico y que a diferencia de hTR se encuentra presente exclusivamente en las células que tienen actividad telomerasa puesto que esta reprimida su expresión en prácticamente todas las células somáticas normales.

FIGURA: 1

La telomerasa cumple la función fisiológica de replicar el DNA a nivel de los telómeros donde se encuentre presente hTERT evitando el acortamiento telomérico. Como se señaló anteriormente, el RNA de la telomerasa esta constituido por 10 – 12 ribonucleótidos complementarios al DNA de los telómeros.

DNA telómero = 5´ - TTAGGGTTAGGG - 3´
RNA telomerasa = 3´ - AAUCCCAAUCCC - 5´

Este RNA sirve como molde proporcionando la secuencia a partir de la cual hTERT (DNA polimerasa) sintetiza el DNA telomérico final, restituyendo la longitud del cromosoma (6). Fisiológicamente las células embrionarias, células tronco totipotenciales de la médula ósea y células germinales poseen telomerasa que restituye y mantiene la longitud de los telómeros en tanto que el resto de las células de la economía no poseen telomerasa por estar reprimida la expresión genética de hTERT (2,7). Sin embargo, estudios realizados en telómeros de neutrófilos circulantes, mostraron acortamiento progresivo de ellos en relación a la edad del individuo y en relación a la utilización de estimulantes de la médula ósea (G, GM-CSF), de lo cual se puede inferir que las células totipotenciales de la médula ósea acortan sus telómeros con cada división celular, probablemente no a la velocidad que ocurre en la generalidad de las células somáticas permitiéndoles mayor sobrevida, este hecho podría ser una explicación del agotamiento de las células totipotenciales medulares cuando se acelera su utilización con quimioterapia y estimulantes de la médula ósea (8). Experimentalmente, se ha inducido déficit de telomerasa en ratas lo que se ha manifestado en espermatogénesis defectuosa, infertilidad y falla en la proliferación de células hematopoyéticas en la médula ósea, lo cual abre una interrogante interesante del punto de vista hematológico ¿Estará relacionado el déficit de telomerasa con el síndrome mielodisplástico y la aplasia o hipoplasia medular?
Como se ha señalado, normalmente con cada división celular la longitud de los telómeros se va acortando hasta llegar al estadio denominado de muerte 1 (M1) o senescente. En este estadio M1 según el tipo celular, la célula se estabiliza y no se divide permaneciendo en Go por tiempo variable (horas, días o años), lo que es controlado fisiológicamente por los genes p53 y Rb (punto de restricción del ciclo celular). Una vez que los genes p53 y Rb de acuerdo a señales externas dejan de actuar, las células pasan de Go a G1 procediendo a dividirse entre 20 – 40 veces mas con el consiguiente acortamiento de los telómeros llegando al estadio de muerte 2 (M2) irreversible, que genera inestabilidad del genoma produciéndose la degradación del final de la hebra de DNA con la consiguiente fusión término – terminal del DNA activándose la apoptosis con lo que la célula completa su ciclo vital. Si aumenta o esta presente la telomerasa se estabilizan los telómeros y no se llega a M2 prolongando la vida de la célula.
En los procesos malignos la sobre expresión genética de la telomerasa induce altos niveles de su actividad, lo que permite la reconstitución de las secuencias teloméricas haciendo a la célula maligna inmortal. Sin embargo, la actividad de telomerasa aumentada en forma aislada no es por si sola suficiente para generar cáncer, como se observa en células germinales que tienen actividad telomerasa elevada durante toda la vida sin generar procesos malignos, ya que para que se induzca una neoplasia es necesario sumar otras alteraciones del genoma (estimadas entre 3 – 6 mutaciones, translocaciones, etc.) que afecten por ejemplo al ciclo celular, apoptosis, adquirir capacidad de invasión sobre los tejidos adyacentes o pérdida de la capacidad de adhesión a su tejido de origen (metástasis). En el cáncer avanzado las células requieren de un mecanismo para mantener los telómeros y permanecer en el tiempo. Se ha señalado que la expresión ectópica de hTERT (human telomerase reverse transcriptase) junto con el oncogen H-RAS serían capaces de mantener viva la célula el tiempo suficiente para que se produzcan las mutaciones necesarias para la conversión maligna.
Por lo tanto podríamos resumir que en el cáncer en general se tendrían dos situaciones: 1) Activación del gen bcl-2 antiapoptótico que impide que muera la célula y junto con ello 2) sobre expresión de telomerasa que implica en células en activa división celular inmortalidad. Estas dos situaciones se podrían observar en cánceres agresivos y de curso agudo es decir de rápida evolución, en tanto que aquellas células malignas de un proceso crónico o de crecimiento lento que generan acumulación de células que se dividen en un muy bajo índice predominaría la acción del gen bcl-2.
Utilidad diagnóstica de telomerasa: Diversas investigaciones han puesto de manifiesto, que aproximadamente en el 90% de cánceres estudiados la telomerasa se encuentra elevada, por lo que su determinación en procesos malignos la hace particularmente importante, especialmente se ha establecido su utilidad en la detección precoz del cáncer. Para su determinación se han implementado diferentes métodos tales como: a) TRAP (telomeric repeat amplification protocol): Que es quizás el método de laboratorio más utilizado. En este ensayo se extrae la telomerasa de las células y se utiliza como template o molde para PCR. Sin embargo, este método ofrece dificultades para extraer totalmente la telomerasa del extracto celular (9,10). b) PCR in situ: Consiste en ensayos que usan primers de telomerasa fluorescentes aplicados en extendidos citológicos, no obstante, el método no es de utilidad práctica para uso clínico por requerir células vivas y técnicas engorrosas (10). c) Determinación de hTR o RNA-telomerasa: Puede ser de utilidad aunque la RNA-telomerasa se encuentra en todas las células normales que no tienen actividad telomerasa, sin embargo, los niveles son mas altos en aquellas células con actividad de telomerasa por estar aumentada la transcripción y la mayor sobrevida celular (11). d) FISH (fluorescent in situ hybridization): Utilizando RNA-telomerasa o hTR antisentido o complementario se puede distinguir entre células normales y cancerosas. La técnica es relativamente sencilla aunque con cierto grado de complejidad pero se podría adaptar bien para uso rutinario (2). e) Inmunocitoquímica: Técnica en la que se detecta telomerasa mediante anticuerpos monoclonales anti hTERT (human telomerase reverse transcriptase) en extendidos celulares (2).
Los ensayos señalados anteriormente se pueden realizar en células obtenidas por biopsias como así también en aquellas obtenidas por medios no invasivos como orina, lavados orales, lavados bronquiales y papanicolaou. Este último ha sido positivo para actividad telomerasa en 88% de cáncer cérvico uterino y falsos positivos en 9% de muestras normales. Se han estudiado diversos procesos malignos como cáncer de hígado, colon, próstata, mamas, piel y pulmón (en este último se ha estudiado además la actividad telomerasa en estados premalignos) encontrándose en aproximadamente 90% de ellos altos niveles de actividad telomerasa como así también en el 70-100% de pacientes portadores de leucemias y linfomas. El 90 – 95% de los casos iniciales de carcinoma del tiroides, páncreas, próstata y colon presentan actividad telomerasa. En el cáncer de vejiga incipiente se detecta en orina o lavado vesical actividad telomerasa en el 90% de los casos, si se compara con el 50% de cáncer incipiente vesical que en la actualidad no se detecta por falta de marcadores citológicos. Otra aplicación útil de la determinación de actividad de telomerasa, es en la formulación de un pronóstico en procesos malignos ya que niveles altos de telomerasa se asocian con pronóstico malo en meningioma, neuroblastoma, leucemia aguda, cáncer de mama y gastrointestinal. Los neuroblastomas 4S presentan niveles bajos o no detectables de actividad telomerasa, hecho importante ya que el neuroblastoma clasificado como 4S, corresponde a una categoría especial de neuroblastoma avanzado metastásico que se presenta en niños, pero que en el 80% de los casos remite espontáneamente. Por lo tanto un objetivo importante en relación al tratamiento de los pacientes portadores de neuroblastoma 4S, es clasificarlos en aquellos que tendrán una evolución favorable post cirugía con aquellos que no la tendrán donde será necesario utilizar quimioterapia o radioterapia, siendo aquí vital la determinación de la actividad telomerasa.
En el caso de enfermedad maligna residual o recidiva también ha demostrado ser importante la determinación de telomerasa como es el caso de biopsias en las cuales se puede detectar áreas de tejido con cáncer residual.
Telomerasa como agente terapéutico: La regulación de la longitud de los telómeros tiene la potencialidad de vencer tanto al cáncer como al envejecimiento, por lo que la manipulación de la longitud de ellos mediante la activación o inactivación de la telomerasa puede ser de gran importancia (12,13). Aparentemente las células malignas requieren de telomerasa para su proliferación continua, de tal modo que si se inhibe la actividad de esta enzima es probable que se pueda detener el crecimiento y la sobrevida del tejido maligno. Se han sintetizado oligonucleótidos inhibidores de telomerasa que consisten en 10-20 secuencias complementarias (antisentido) de hTR (human telomerase RNA) que bloquea o impide su actividad como primer o iniciador de la hTERT (human telomerase reverse transcriptase). Se ha usado in-vitro en células malignas induciendo un progresivo acortamiento de los telómeros con muerte celular por apoptosis (12). Cuando se suspenden los oligonucleótidos, los telómeros vuelven a ganar en longitud es decir la actividad de este inhibidor de telomerasa es reversible lo que da excelentes proyecciones a la clínica. Sin embargo, esta terapia puede requerir tratamiento prolongado para acortar suficientemente los telómeros en las células malignas y así inducir su muerte, además puede ser necesario complementarla con terapia standard (quimioterapia, radioterapia). Se debe recordar que normalmente no se expresa hTERT en células somáticas normales, por lo que la acción de los inhibidores se ejerce principalmente en las células del proceso maligno. El efecto que pudieran tener estos inhibidores en las células que normalmente tienen actividad telomerasa como las células tronco de la médula ósea, al parecer sería mínimo si consideramos que estas células están en Go, siendo sintetizada la telomerasa cuando entran a G1 y en ese estado pudieran ser afectadas.
Estudios in-vitro han demostrado que el cromosoma 3 normalmente contiene el gen que reprime la actividad telomerasa, de tal modo que su inhibición en células somáticas podría ser utilizada para activar la telomerasa. En cambio, en la célula maligna en las cuales la actividad telomerasa está aumentada, podría inducirse represión de ella mediante los genes del cromosoma 3. En condiciones normales, las células somáticas reciben señales que transducen información que bloquea, por mecanismos desconocidos, la represión hTERT en los genes presentes en el cromosoma 3 activando la telomerasa, lo mismo ocurre en células malignas cuyo mecanismo de activación aún no se conocen. Otra vía de activación de la telomerasa es mediante la administración de su fracción catalítica hTERT, activación que puede ser importante en el proceso de cicatrización como por ejemplo en úlceras por decúbito o de otra causa, regenerar o renovar vasos sanguíneos u otros tejidos dañados, reemplazar córneas, células retinales, islotes de Langerhans, etc. como así también en la prolongación de la vida.
En conclusión, los telómeros son importantes en la regulación de la vida celular, representando el reloj biológico que la controla. En los procesos malignos la expresión de telomerasa contribuye a mantener la vida de dichas células en forma indefinida. De aquí que la activación o inhibición de la telomerasa sea potencialmente importante del punto de vista clínico. Por una parte la administración de INHIBIDORES de la telomerasa podría detener el crecimiento celular maligno y por otra, la activación de la TELOMERASA sería de utilidad para reparar tejidos y prolongar la vida.


CITA DE ESTE TRABAJO: Casanova ER. Telómeros. www.egoncasanova.cl Mayo 2003


 

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